轮状病毒（RVs）是呼肠孤病毒科双链RNA（dsRNA）病毒中的一个属，基因组由11段dsRNA组成，编码6种结构性蛋白（VP1-VP4、VP6和VP7）和5种非结构性蛋白（NSP1-NSP5/6）。根据VP6蛋白的抗原性不同，轮状病毒被分为10个血清型型（A-J），感染人和动物最常见的是A、B和C型，其中A型毒株的流行率最高。
轮状病毒无处不在，每头猪的一生中起码会感染一次轮状病毒，有些还会多次感染。年龄大的猪中已有多种轮状混合病毒的报道。感染猪的年龄是决定感染率和疾病严重程度的最重要因素之一。未建立免疫力的小猪和没有获得轮状病毒特异性母源抗体的小猪更容易感染轮状病毒。轮状病毒感染的母猪在产房排毒，增加了仔猪感染轮状病毒的风险。
近年来轮状病毒从腹泻猪场的检出率不断上升，越来越引起大家的关注。但目前对于猪轮状病流行情况和病毒的分子特征研究不多，本研究以山东省腹泻猪场为对象，调查了不同区域猪轮状病毒的流行情况及其基因分型。
本研究发现：
1、山东不同地区出现腹泻的猪场100%检出猪流行性腹泻病毒，60%的猪场检出轮状病毒，10%的猪场检出传染性胃肠炎病毒。
2、分别对轮状病毒的VP4、VP6、VP7基因测序分析发现，山东地区流行的轮状病毒有多个血清型和基因型；
3、轮状病毒是引起猪场病毒性腹泻的第二大病原体，对轮状病毒的防控建议依据本区域流行毒株选择疫苗。
Diversity of group A rotavirus of porcine rotavirus in Shandong province China
山东省猪场A群猪轮状病毒的基因多样性
全文链接：
https://www.medsci.cn/sci/show_paper.asp?id=1960d11e9c118978
摘要
猪轮状病毒(轮状病毒)在全球养猪业中都是引起新生仔猪腹泻的主要病原之一。在哺乳仔猪和断奶仔猪的腹泻病例中发现多种血清型的轮状病毒。到目前为止，山东省轮状病毒的流行情况和分子特征尚不清楚。从山东省10个出现腹泻的猪场采集粪便样本226份。对所有样本进行了轮状病毒、传染性胃肠炎病毒或猪流行性腹泻病毒的RT-PCR检测。结果表明，100%猪场均为猪流行性腹泻病毒阳性，60%的猪场为轮状病毒阳性，10%的猪场为传染性胃肠炎病毒阳性。来自1~3月龄哺乳和断奶仔猪的226份样品中，65份(28.76%)检出轮状病毒，而传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的阳性率分别为2.21%和34.96%。
目前的资料表明，轮状病毒是引起中国猪群腹泻的重要病原。此外，对轮状病毒的VP6和VP7基因进行了测序和分析。VP6的系统发育分析表明，5株轮状病毒均属于轮状病毒A群，VP7基因结果显示这些毒株属于G3、G5和G9三种基因型。此外，G5和G9两种基因型为优势基因型。综上所述，山东省猪群中存在传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和轮状病毒的混合感染，感染的轮状病毒属于多种血清型，建议进行主动监测，使用疫苗时注意配型。
关键词：轮状病毒;腹泻;仔猪;VP6;VP7;山东
背景
仔猪腹泻是由细菌、病毒或寄生虫引起的一种严重的传染病综合征，常发生在冬春季，造成严重的经济损失。轮状病毒是引起仔猪腹泻的重要病原体，也是许多动物幼年腹泻的重要病原体。例如，从世界各地的牛上都分离到了牛轮状病毒。人类轮状病毒由Bishop等于1979年发现，次年Woode等从感染的猪上分离到猪轮状病毒。感染猪轮状病毒的仔猪在潜伏期12-14小时后表现出厌食、躁动不安和偶尔呕吐。更严重的是，仔猪大量水样腹泻，不仅导致仔猪生长缓慢，而且导致高死亡率。
轮状病毒属于呼肠孤病毒科，是一个无囊膜的二十面体颗粒。根据VP6基因的抗原决定簇，轮状病毒被分为八个血清型(A-H)和两个亚型(I和II)。其中，A、B、C和H型的毒株可感染人和许多其他物种；然而，D、E、F和G型的毒株仅在鸟类和猪上发现。在猪中已经检测到五个血清型(RVA、RVB、RVC、RVE和RVH)，其中A型轮状病毒(RVA)被认为是最重要的是肠道疾病。A型轮状病毒也对世界养猪业造成严重的经济损失。在英国，2009年和2010年粪便样本中A型轮状病毒阳性率达到80%。Molinari等2016报道，比利时有腹泻症状的养猪场中61%是A或者C型轮状病毒。在巴西，46%的猪腹泻样本是A型轮状病毒阳性。
轮状病毒基因组由11个双链RNA片段组成，编码6个结构蛋白(VP1-VP4、VP6和VP7)和5个非结构蛋白(NS53、NS35、NS34、NS28和NS26)。VP6基因编码衣壳中间层，在病毒复制中起重要作用。同时，VP6蛋白是物种特异性的主要决定因素。VP7基因编码衣壳外层，它是诱导中和抗体的主要免疫原。轮状病毒的基因类型非常多，其中VP7基因对应的是G-基因分型。同一种G-基因型的轮状病毒毒株至少有90-91%的VP7氨基酸同源性。迄今为止，已从许多物种中鉴定出27种G基因型。到目前为止，在有症状和无症状的感染中发现了12种G基因型(G1到G6、G8到G12和G26)。
山东省拥有中国最大的养猪业，然而，轮状病毒在山东省的流行情况和分子特征尚不清楚。
材料和方法
样本收集：2013年10月至2014年10月山东省不同地区的10个养猪场采集了226份仔猪粪便样本(表1)。来自有不同程度腹泻的3周龄以下仔猪。样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1：5的比例稀释，在5000×g下离心10min。收集上清液进行进一步分析。
表1.山东省10个猪场仔猪新鲜粪便中轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的检出率
RNA提取和RT-PCR：根据产品说明书，使用TRIzol®试剂从粪便标本中提取病毒RNA(美国Thermo Fisher)。1μl核糖核酸、2μl Prime SCRIPT®一步酶混合液、1μl正反向引物(20μm ol/l)、12.5μl 2×一步缓冲液、总体积为25μl的无核酸水。RT-PCR扩增条件包括在50℃下逆转录30min，然后在95℃下变性10min，然后进行32个循环的扩增(94℃下1min，53℃下30s，72℃下30s)，最后在72℃下延伸10min。所有RT-PCR产物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并在紫外光透射仪下显示。
引物：为了检测这3种病原体，设计了3对特异性引物，分别针对猪流行性腹泻病毒的N基因、传染性胃肠炎病毒的M基因、轮状病毒针的VP6基因。另设计两对针对轮状病毒 VP7和VP4基因的引物，扩增出全长基因片段，用于进一步分析。所有的引物序列汇总在表2中。
表2.猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的引物序列
基因分型：为鉴定轮状病毒的基因型，扩增了VP4、VP6和VP7基因，并将扩增产物纯化后克隆到pMD®18-T。VP4、VP6、VP7基因序列由山东省农业科学院测序中心完成。使用MEGA 6软件排列和编辑这些序列。本研究获得的核苷酸序列已登录GenBank(KT820766~KT820783)。通过将VP4、VP6和VP7基因的核苷酸序列与GenBank提供的参考毒株的核苷酸序列进行比较，进行分子分析。使用CLUSTAL W通过MEGA 6软件进行多个序列的比对。用邻接法构建系统发育树，设置1000个Bootstrap重复。
结果
检测结果：检测结果表明，在1~3月龄哺乳和断奶仔猪的226份样品中，65份(28.76%)检出轮状病毒。传染性胃肠炎病毒阳性率为2.21%(5/226)，猪流行性腹泻病毒阳性率为34.95%(79/226)。此外，所有被调查的猪场都有猪流行性腹泻病毒阳性，其中60%的猪场轮状病毒阳性，10%的猪场传染性胃肠炎病毒阳性。此外，泰安某猪场轮状病毒阳性率高达63.38%(Tab1)。首次表明轮状病毒是引起山东猪群腹泻的第二大病原，仅次于猪流行性腹泻病毒。此外，3.10%的样品同时检出猪流行性腹泻病毒和轮状病毒，表明这两种病原体在猪之间存在重叠感染。但传染性胃肠炎病毒的阳性率低于其他两种病原体。
通过对VP4、VP6和VP7基因的测序，证实在5个阳性样本(分别为LY-1、TA-1-1、TA-4-1、WF-1-1、JN-1)中存在轮状病毒 RNA。本研究中获得的核苷酸序列已在GenBank中与ACC一起保存。KT820766至KT820783号。
基因分型：5株轮状病毒的VP6氨基酸同源性在91.20%~99.0%之间，与A型轮状病毒的同源性为87.40%~99.50%，与C型(35.0%~41.20%)和B型(10.20%~11.0%)的同源性较低。类似地，系统发育分析显示有5个轮状病毒都属于A型分支上，表明5株毒株都属于轮状病毒 A型(图1)。
图1 基于猪轮状病毒株VP6基因核苷酸序列的系统发育树
（在这项研究中分离出的病毒以粗体和红色表示。毒株名称按照：毒株名称/注册号/年份/国家表示。标尺代表遗传距离。）
通过对5株轮状病毒VP7基因序列的系统发育分析和与代表毒株的比对，5株轮状病毒VP7氨基酸序列的同源性在81.3%~99.7%之间。WF-1-1和JN-1毒株与G5基因型参考毒株有很高的相似性(93.90%到99.10%)(图2)。LY-1和TA-1-1毒株与G9基因型参考毒株的相似性(94.5%~98.5%)。值得注意的是，与TA-1-1分离自同一地区的TA-4-1毒株与G3参考毒株的亲缘关系(93.60%)比与G9参考毒株的亲缘关系(86.50%-87.50%)更近(图2)。
图2 基于猪轮状病毒株VP7基因核苷酸序列的系统发育树
（在这项研究中分离出的病毒以粗体和红色表示。毒株名称按照：毒株名称/注册号/年份/国家表示。标尺代表遗传距离。）
在系统发育分析和VP4基因序列与代表毒株比对的基础上，VP4基因与5个轮状病毒分离株的同源性在81.3%~99.7%之间。系统进化树表明，TA-4-1、WF-1-1和JN-1毒株与P13代表毒株亲缘关系较近(图3)。TA-1-1毒株与P23参考毒株在同一分支，LY-1与P6代表毒株亲缘关系更近(图3)。
图3 基于猪轮状病毒株VP4基因核苷酸序列的系统发育树
（在这项研究中分离出的病毒以粗体和红色表示。毒株名称按照：毒株名称/注册号/年份/国家表示。标尺代表遗传距离。）
讨论
轮状病毒是引起猪腹泻的主要病原之一，但仅凭临床症状很难与猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒区分开来。轮状病毒不仅引起腹泻，而且抑制免疫系统，导致仔猪生长停滞和死亡率增加。在本研究中，100%的被调查猪场猪流行性腹泻病毒阳性，10%的猪场传染性胃肠炎病毒和60%的轮状病毒阳性。此外，采集的样本中轮状病毒和猪流行性腹泻病毒的阳性率分别为28.76%和34.95%。猪流行性腹泻病毒是引起中国猪群腹泻的主要病原，但目前轮状病毒的流行情况尚不清楚。我们的数据首次表明轮状病毒似乎是引起中国猪腹泻的第二大病原体。
VP6是轮状病毒的一个结构性蛋白，与VP4、VP7共同构成病毒的骨架。通过系统发育分析，5株病毒均与A型轮状病毒位于同一分支。结果表明，2013-2014年间，A型轮状病毒是山东省猪群流行的流行群。
VP7基因是轮状病毒的主要免疫保护性抗原，它不仅能刺激机体产生抗体，还能决定轮状病毒的G基因型分型。以往的研究表明，VP7基因的高变区位于VP7基因区域。VP7基因编码的抗原位点在不同的基因型间几乎没有交叉保护作用。
这项研究揭示了山东流行的轮状病毒的基因型有多种。例如，从潍坊地区分离的WF-5-2株属于G5基因型，而从临沂地区分离的LY-2株属于G9基因型。有趣的是，从泰安地区分离的轮状病毒属于不同的基因型，如从泰安同一地点分离的TA-1-2和TA-4-2毒株，分别属于G9和G3型。因此，应根据不同地区流行的不同基因型使用对应的疫苗。
译者简介
吴朝亮
湖南农业大学预防兽医学硕士
吴朝亮，湖南农业大学预防兽医学硕士，执业兽医师。曾在国家级保种场，国家级核心育种场任职，负责猪场生物安全体系建立与疫病防控。
